Кратко о методе флуоресцентной микроскопии
Метод основан на способности фоточувствительных молекул к структурной интеграции с микрообъектами. Они прикрепляются к образцам с помощью функциональных химических групп и при световом облучении возвращают часть поглощенных фотонов.
Исследователи принимают и анализируют интенсивность волновых сигналов, делая выводы о строении изучаемых объектов и протекающих в них процессах.
Принцип флуоресценции соединений.
Какие процессы участвуют
При флуоресценции происходят поглощение квантов и их последующее частичное высвобождение. Электроны облучаемого флуорофора приобретают дополнительную энергию и на мгновение перемещаются на более высокий энергетический уровень.
При возвращении в первичное состояние происходит высвобождение фотонов во внешнюю среду. В этом процессе часть энергии тратится на восстановление термодинамического равновесия, поэтому величина испускаемой волны больше длины волны возбуждения. Разницу между энергиями возбуждающего и испускаемого излучений называют стоксовым сдвигом.
Формирование изображения
Микроскопы оснащены электронными модулями, позволяющими визуализировать исследуемые объекты при низких уровнях световых сигналов. Эти узлы содержат устройства с зарядовой связью, способные преобразовывать волновую энергию в фототок.
Далее электрические заряды сканируются регистрами сдвига и преобразуются в аналоговые, а затем в цифровые сигналы. На основе полученных данных формируется изображение высокого разрешения в 12- или 16-битном формате.
Ключом к качественной визуализации является правильный подбор оптических фильтров, гарантирующих надежное разделение испускаемого тусклого от возбуждающего яркого света.
Оптическая схема микроскопа.
Функциональные составные микроскопа
Данное оборудование содержит в себе три главные составные части: осветительная, воспроизводящая и визуализирующая. Осветительная составная микроскопа необходима для того, чтоб воссоздавать поток света так, чтоб другие части прибора, как можно точнее делали свою работу. Осветительная часть оборудования для проходящего светового потока находится непосредственно за препаратом, если микроскоп прямой, а если микроскоп инвертированный, то перед объектом и поверх объектива.
Осветительная составная прибора содержит в себе источник освещения, который может быть представлен лампой, или же электрическим блоком питания, а также всевозможную механическую оптику, в которую входят: конденсоры, коллекторы, полевые и апертурные регулируемые и ирисовые диафрагмы.
Воспроизводящая составная микроскопа нужна для того, чтоб воспроизводить объект непосредственно в горизонтали картинки с необходимым для рассмотрения визуальными качествами и увеличением. Это значит, что воспроизводящая составная нужна для такого отображения картинки в окуляре, какое наиболее точно и детально показывает объект с определённым разрешением для оптики микроскопа передачей цвета и контрастности.
С помощью воспроизводящей части удаётся добиться первой ступени увеличения картинки и находится она за объектом до горизонтали изображения прибора. Воспроизводящие части прибора также имеют объективы, и промежуточные системы стационарной оптики.
Сегодня это оборудование работает с помощью специальных систем объективов и оптики, которые скорректированы на отметку бесконечности. Для этого в приборах используют тубусные системы, благодаря которым параллельные лучи света, выходящие через объектив, соединяются в плоскости картинки в микроскопе.
Визуализирующие составные прибора необходимы для того, чтоб получать настоящую картинку исследуемого предмета на сетчатке, пластине, пленке, на мониторе с большой второй степенью увеличения.
Визуализирующие части в микроскопе находится между камерой или сетчаткой глаза, а также горизонталью картинки объектива. Эти части содержат в себе визуальные насадки монокулярного, бинокулярного или тринокулярного типа со специальными системами наблюдения, которые представляет собой окуляры, работающие по принципу лупы.
Помимо этого, визуализирующая часть микроскопа также содержит в себе дополнительные увеличительные системы, всевозможные насадки для проекции, включая также и дискуссионные для нескольких исследователей. Также система включает в себя приспособления для рисования, проведения анализа, а также фиксирования картинки с определёнными согласующими частями.
Флуоресцентная краска
Ответить на вопрос, что это за краски, могут многие. Действительно, флуоресцентные краски относятся к декоративному лакокрасочному материалу, у которого своеобразная реакция на воздействие светового потока. Изделия, покрытые таким составом, заметны при любом освещении. Причем, ночью они намного ярче, чем в дневное время. Профессионалы подчеркивают, что свечение интенсивнее практически вдвое.
Высокий спрос подобны материалов, естественно, объясняется необычным эффектом и поэтому краски быстро заметили.
Флуоресцентная светящиеся краска
Разнообразие предлагаемых красок имеет широкий диапазон. На ваш выбор предлагаются белые, коричневые, красные, синие, жёлтые, зелёные краски. Интересно, что они бывают видимыми и не видимыми. У не видимой краски особенность – увидеть её в дневное время практически невозможно. Проявится она только при воздействовании ультрафиолетовых лучей.
Видимую краску различить легко, однако, при попадании солнечных лучей происходит усиление свечения.
Преимущественно распространённой флуоресцентным красящим составом можно назвать акриловый, основа которого водная. В состав входят краситель, связывающий элемент (акриловая полимерная эмульсия) и приготовленная особым способом вода. Те, кто пользовался этим составом, отмечают уникальность продукта.
К преимуществам материала относятся:
- Универсальность – можно использовать как внутри помещений, так и на улице.
- Лёгкость при использовании – при производстве работ достаточно пульверизатора, кисточки, краскораспылителя или валика.
- Насыщенность окрашенной поверхности – дополнительно защитить от неблагоприятных погодных условий можно с помощью лака на полиуретановой основе.
- Хорошо и экономно ложится на поверхность.
- Высыхает достаточно быстро.
- Безупречные покупательские свойства – не подвергаются потускнению, окраска не теряет цвета под действием солнечных лучей.
- Не наносят вред здоровью человека.
- Разнообразная область применения – можно окрашивать бумажную основу, живые цветы и древесину, бетонные и каменные поверхности, пластик и металл.
Использование красителей с флуоресцентным спецэффектом достаточно широкое.
Необычное свойство материала с успехом можно использовать в качестве:
- Нанесение пометок – обозначение сигнальных полос и знаков на транспорте.
- Окраска различных объектов – оборудование, дорожные знаки, «маячки».
- Маркировка фрагментов трубопровода, станка, инвентаря, имеющих опасные участки.
Биология
§ 6. Устройство увеличительных приборов
- Какие увеличительные приборы вы знаете?
- Для чего их применяют?
Если разломить розовый, недозревший, плод томата (помидор), арбуза или яблока с рыхлой мякотью, то мы увидим, что мякоть плодов состоит из мельчайших крупинок. Это клетки. Они будут лучше видны, если рассмотреть их с помощью увеличительных приборов — лупы или микроскопа.
Устройство лупы. Лупа — самый простой увеличительный прибор. Главная его часть — увеличительное стекло, выпуклое с двух сторон и вставленное в оправу. Лупы бывают ручные и штативные (рис. 16).
Рис. 16. Лупа ручная (1) и штативная (2)
Ручная лупа увеличивает предметы в 2—20 раз. При работе её берут за рукоятку и приближают к предмету на такое расстояние, при котором изображение предмета наиболее чётко.
Штативная лупа увеличивает предметы в 10—25 раз. В её оправу вставлены два увеличительных стекла, укреплённых на подставке — штативе. К штативу прикреплён предметный столик с отверстием и зеркалом.
Устройство лупы и рассматривание с её помощью клеточного строения растений
- Рассмотрите ручную лупу. Какие части она имеет? Каково их назначение?
- Рассмотрите невооружённым глазом мякоть полуспелого плода томата, арбуза, яблока. Что характерно для их строения?
- Рассмотрите кусочки мякоти плодов под лупой. Зарисуйте увиденное в тетрадь, рисунки подпишите. Какую форму имеют клетки мякоти плодов?
Устройство светового микроскопа. С помощью лупы можно рассмотреть форму клеток. Для изучения их строения пользуются микроскопом (от греческих слов «микрос» — малый и «скопео» — смотрю).
Световой микроскоп (рис. 17), с которым вы работаете в школе, может увеличивать изображение предметов до 3600 раз. В зрительную трубку, или тубус, этого микроскопа вставлены увеличительные стёкла (линзы). В верхнем конце тубуса находится окуляр (от латинского слова «окулус» — глаз), через который рассматривают различные объекты. Он состоит из оправы и двух увеличительных стёкол.
На нижнем конце тубуса помещается объектив (от латинского слова «объектум» — предмет), состоящий из оправы и нескольких увеличительных стёкол.
Тубус прикреплён к штативу. К штативу прикреплён также предметный столик, в центре которого имеется отверстие и под ним зеркало. Пользуясь световым микроскопом, можно видеть изображение объекта, освещенного с помощью этого зеркала.
Рис. 17. Световой микроскоп
Чтобы узнать, насколько увеличивается изображение при использовании микроскопа, надо умножить число, указанное на окуляре, на число, указанное на используемом объекте. Например, если окуляр даёт 10-кратное увеличение, а объектив — 20-кратное, то общее увеличение 10 х 20 = 200 раз.
Порядок работы с микроскопом
- Поставьте микроскоп штативом к себе на расстоянии 5—10 см от края стола. В отверстие предметного столика направьте зеркалом свет.
- Поместите приготовленный препарат на предметный столик и закрепите предметное стекло зажимами.
- Пользуясь винтом, плавно опустите тубус так, чтобы нижний край объектива оказался на расстоянии 1—2 мм от препарата.
- В окуляр смотрите одним глазом, не закрывая и не зажмуривая другой. Глядя в окуляр, при помощи винтов медленно поднимайте тубус, пока не появится чёткое изображение предмета.
- После работы микроскоп уберите в футляр.
Микроскоп — хрупкий и дорогой прибор: работать с ним надо аккуратно, строго следуя правилам.
Устройство микроскопа и приёмы работы с ним
- Изучите микроскоп. Найдите тубус, окуляр, объектив, штатив с предметным столиком, зеркало, винты. Выясните, какое значение имеет каждая часть. Определите, во сколько раз микроскоп увеличивает изображение объекта.
- Познакомьтесь с правилами пользования микроскопом.
- Отработайте последовательность действий при работе с микроскопом.
Вопросы
- Какие увеличительные приборы вы знаете?
- Что представляет собой лупа и какое увеличение она даёт?
- Как устроен микроскоп?
- Как узнать, какое увеличение даёт микроскоп?
Задания
Выучите правила работы с микроскопом.
Используя дополнительные источники информации, выясните, какие подробности строения живых организмов позволяют рассмотреть самые современные микроскопы.
Знаете ли вы, что…
Световые микроскопы с двумя линзами были изобретены в XVI в. В XVII в. голландец Антони ван Левенгук сконструировал более совершенный микроскоп, дающий увеличение до 270 раз, а в XX в. был изобретён электронный микроскоп, увеличивающий изображение в десятки и сотни тысяч раз.
Подробно о конструкции и принципе работы микроскопа
Устройство разработано на базе традиционного оптического микроскопа, но имеет иной принцип работы. Исследуемый образец помечают люминесцирующими веществами, а затем с помощью сложной системы фильтров собирают испускаемые фотоны и визуализируют микрообъекты.
Устройство микроскопа
В основном прибор обладает всеми модулями, характерными для оптических микроскопов. Однако он, в отличие от них, оснащен флуоресцентным модулем.
Задачами данного технологического узла являются направление возбуждающего излучения на образец и последующее отделение отраженного света от общего потока. Для этого используется сложная система фильтров, объединенных в единый блок.
Такие приборы плохо подходят для возбуждения флуоресцирующих красителей, поглощающих излучение в коротковолновом диапазоне. Вместо них применяют галогенные или светодиодные лампы.
Устройство флуоресцентного микроскопа.
Конструкция фильтров-блоков
В основе конструкции микроскопа лежит блок, включающий набор следующих оптических элементов:
- фильтра возбуждения;
- дихроичного светоделителя;
- эмиссионного фильтра.
Фильтр возбуждения принимает излучение от источника света, пропуская длины волн заранее установленного диапазона. Дихроичное зеркало сначала отражает фотоны через оптический объектив на образец, а затем направляет флуоресценцию к системе обнаружения. Далее на пути испускаемого излучения стоит эмиссионный фильтр, который блокирует нежелательные волны.
При установке фильтров важно обеспечить правильный угол наклона и ориентацию относительно светового пути, чтобы эффективно управлять фотонным потоком. Производители помечают в основном белой точкой отражающую сторону дихроичного зеркала, а на остальных деталях указывают направляющие стрелки
Производители помечают в основном белой точкой отражающую сторону дихроичного зеркала, а на остальных деталях указывают направляющие стрелки.
Конструкция и спектральная характеристика фильтр-блоков.
Используемые осветители
В качестве источников света люминесцентные микроскопы чаще используют галогенные лампы. Они имеют небольшие размеры, хорошую цветопередачу и невысокую стоимость. Однако из-за низкой яркости и малого срока службы эти устройства постепенно вытесняются светодиодными LED-элементами.
Источники света на основе LED-технологии считаются самыми востребованными в современной микроскопии. Это универсальные полупроводниковые осветители, обладающие широким набором спектральных характеристик. Они позволяют использовать излучение в диапазоне от ультрафиолетовой до ближней инфракрасной зоны.
Это надежные и непрерывно работающие установки, обладающие наиболее высокими значениями яркости по сравнению галогенными и светодиодными приборами.
Однако они имеют ряд существенных недостатков: малый срок службы, изменение спектральной характеристики с возрастом и продолжительные интервалы между выключением и включением.
Спектральная интенсивность ртутной лампы НВО 100.
Флуоресцентные камеры
Камера считается одним из важнейших и самых дорогих компонентов микроскопа. Она должна обладать высокой чувствительностью и низким уровнем шума, чтобы захватить как можно больше фотонов.
Для флуоресцентной визуализации предпочтительно монохромное устройство, которое обеспечивает одинаковое обнаружение сигналов на всех пикселях и увеличивает общую чувствительность.
Они преобразуют волновые сигналы в электрические заряды, которые поступают на усилитель, а затем передаются в аналогово-цифровой преобразователь.
В CCD-камерах все сигналы сканируются одновременно, что позволяет снизить уровень шума и повысить чувствительность. В sCMOS-устройствах считывание происходит произвольно, вследствие чего возникают нежелательные вибрации, искажается геометрия объектов при визуализации.
Выбор камеры зависит от типа исследуемых образцов, требуемой частоты кадров, угла обзора, разрешения и чувствительности. Например, для промышленных изысканий необходимы высокое качество изображений и скорость работы, а для медико-биологических исследований важнее чувствительность устройства.
Высокочувствительные камеры с большим разрешением.
Обозначения для фильтров
Производители разрабатывают собственные системы кодов для обозначения фильтров, используемых во флуоресцентной микроскопии, что нередко приводит к путанице в терминологии. Кодировка в основном отражает вещественный состав изделия или его функциональные свойства.
При маркировке фильтров возбуждения часто используют аббревиатуры UG и BG, обозначающие ультрафиолетовое и синее стекла соответственно.
Дихроичные светоделители маркируются следующими акронимами: DM — дихроичное зеркало, CBS — хроматический светоделитель, TK — щелевой делитель, FT — делитель цвета, RKP — узкополосный отражатель. Все эти обозначения взаимозаменяемы.
Эмиссионные фильтры кодируются следующими символами: L или LP — широкополосный элемент, GG или Y — желтое стекло, OG или O — оранжевое стекло, RG или R — красное стекло, BA — запирающее стекло, K — щелевой фильтр.
Иногда наряду с акронимом присутствует числовое значение, указывающее на длину волны в нанометрах, на которой фильтр достигает половины величины максимальной пропускной способности.
Флуоресцентный светофильтр.
Как выбрать микроскоп для ребенка: практические советы и лучшие модели
Причины купить микроскоп для ребенка могут быть разными. Это и удовлетворение интереса юного исследователя к природе, и подготовка к школьным, и даже к институтским занятиям по биологии. Ведь такой прибор прослужит далеко год и даже не два – при хорошем обращении срок службы составит несколько десятилетий.
фото: компании-производители, pixabay.com
С помощью хорошего микроскопа можно проводить серьезные исследования даже без покупки профессиональной модели. Однако выбор подходящего варианта может оказаться довольно непростым делом. И, решая, какой выбрать микроскоп для школьника, стоит познакомиться и с особенностями этих оптических приборов, и с рейтингом лучших моделей.
Увеличение
Первое, на что обращает внимание большинство выбирающих микроскоп людей — это его увеличение. Но, хотя считается, что большая кратность — это хорошо, на самом деле ситуация немного другая
Чем больше увеличивает оптика, тем меньше становится поле зрения. И, получая большую картинку, исследователь может не понять, что именно он рассматривает на образце.
Для того чтобы лучше понять, какой микроскоп подойдет ребенку, стоит познакомиться с понятием полезного увеличения. Термин означает такую кратность, после превышения которой прибор работает как обычная лупа — то есть увеличивает, но не добавляет деталей.
Увеличения в 1000 раз может достигать профессиональный прибор, цена которого слишком большая для его покупки ребенку. А вот уже 400-600х хватит и для простых исследований, и для школьных лабораторных — и даже для пайки радиодеталей, при которой тоже может пригодиться недорогой микроскоп.
Система фокусировки
Перед тем, как выбрать микроскоп, стоит обратить внимание еще и на способы фокусировки. То есть — на механизмы, которые позволяют увеличить резкость
Чаще всего у прибора перемещается предметный столик. Но у некоторых моделей есть подвижный оптический блок — такая фокусировка часто применяется на стереомикроскопах, позволяющих исследование не микроскопических, а крупных предметов весом больше 100 г.
Оба способа фокусировки основаны на реечной передаче, надежность и долговечность которой зависит от материала. Для повышения срока службы микроскопа следует выбрать модель с металлической, а не пластиковой ведущей шестерней фокусировочного механизма.
Кроме того, фокусировка может быть точной или грубой. Первый вариант больше подходит для профессиональных моделей. А, решая, как выбрать микроскоп для дома, стоит остановиться на грубой — от 0,2 до 2 мм. Точная фокусировка может понадобиться только в тех случаях, когда ребенок уже серьезно увлекся наукой и не просто рассматривает не стандартные образцы, а сам выбирает объекты для изучения.
Число окуляров
Самый простой и выгодный вариант микроскопа — монокуляр. То есть прибор, позволяющий рассматривать увеличенные объекты только одним глазом. Бинокулярные модели подходят для длительного изучения и вряд ли будут хорошим вариантом для младшеклассника. А вот ребенку среднего или старшего школьного возраста модель с двумя окулярами может и пригодиться.
Еще один вариант – микроскопы с 3 окулярами. Они встречаются нечасто, но могут стать хорошим вариантом для съемки с помощью камеры. Видеокамеру подключают к третьему окуляру и выводят с нее картинку на монитор.
Цена такого оптического прибора выше, чем у бинокулярных или монокулярных моделей, и обычно они используются в лабораториях, а не дома. Но для серьезного исследования тринокуляр пригодится больше.
Дополнительные функции
Список функций, важных при принятии решения, какой микроскоп выбрать, включает и подсветку. Несколько расположенных над или под предметным столом светодиодов помогут лучше рассмотреть исследуемые объекты. А еще лучше выбрать устройство с комбинированной подсветкой, подходящей для работы и с прозрачными, и с непрозрачными образцами и срезами.
Еще одна интересная функция — встроенная камера. Модели такого типа называют цифровыми. Их преимущества — возможность сразу снимать увеличиваемый объект и не пользоваться внешними устройствами. Недостаток — высокая цена, далеко не лучшее разрешение и размытие при большом увеличении.
Для съемки можно купить и тринокуляр, способный работать с разными камерами — в том числе, с более функциональными и качественными по сравнению с комплектными моделями.
История создания
Хотя первые увеличительные линзы, на основе которых собственно и работает световой микроскоп, археологи находили еще при раскопках древнего Вавилона, тем не менее, первые микроскопы появились в Средневековье. Что интересно, среди историков нет согласия по поводу того, кто первым изобрел микроскоп. Среди кандидатов на эту почтенную роль такие известные ученые и изобретатели как Галилео Галилей, Христиан Гюйгенс, Роберт Гук и Антонии ван Левенгук.
Стоит также упомянуть итальянского врача Г. Фракосторо, который еще в далеком 1538 году первым предложил совместить несколько линз, чтобы получить больший увеличительный эффект. Это еще не было созданием микроскопа, но стало предтечей его возникновения.
А в 1590 году некто Ханс Ясен, голландский мастер по созданию очков заявил, что его сын – Захарий Ясен – изобрел первый микроскоп, для людей Средневековья такое изобретение было сродни маленькому чуду. Однако, ряд историков сомневается в том, является ли Захарий Ясен истинным изобретателем микроскопа. Дело в том, что в его биографии немало темных пятен, в том числе пятен и на его репутации, так современники обвиняли Захарию в фальшивомонетчестве и краже чужой интеллектуальной собственности. Как бы там ни было, но точно узнать был ли Захарий Ясен изобретателем микроскопа или нет, мы, к сожалению, не можем.
А вот репутация Галилео Галилея в этом плане безупречна. Этого человека мы знаем, прежде всего, как, великого астронома, ученого, гонимого католической церковью за свои убеждения о том, что Земля вращается вокруг Солнца, а не наоборот. Среди важных изобретений Галилея – первый телескоп, с помощью которого ученый проник своим взором в космические сферы. Но сфера его интересов не ограничивалась лишь звездами и планетами, ведь микроскоп, это по сути тот же телескоп, но только наоборот. И если с помощью увеличительных линз можно наблюдать за далекими планетами, то почему бы не обратить их мощь в другое направление – изучить то, что находится у нас «под носом». «Почему бы и нет», – наверное, подумал Галилей, и вот, в 1609 году он уже представляет широкой публике в Академии деи Личеи свой первый составной микроскоп, который состоял из выпуклой и вогнутой увеличительных линз.
Старинные микроскопы.
Позднее, спустя 10 лет, голландский изобретатель Корнелиус Дреббель усовершенствовал микроскоп Галилея, добавив в него еще одну выпуклую линзу. Но настоящую революцию в развитии микроскопов совершил Христиан Гюйгенс, голландский физик, механик и астроном. Так он первым создал микроскоп с двухлинзовой системой окуляров, которые регулировались ахроматически. Стоит заметить, что окуляры Гюйгенса применяются и по сей день.
А вот знаменитый английский изобретатель и ученый Роберт Гук навеки вошел в историю науки, не только как создатель собственного оригинального микроскопа, но и как человек, сделавший при его помощи великое научное открытие. Именно он первым увидел через микроскоп органическую клетку, и предположил, что все живые организмы состоят из клеток, этих мельчайших единиц живой материи. Результаты своих наблюдений Роберт Гук опубликовал в своем фундаментальном труде – Микрографии.
Опубликованная в 1665 году Лондонским королевским обществом, эта книга тут же стала научным бестселером тех времен и произвела подлинный фурор в научном сообществе. Еще бы, ведь в ней имелись гравюры с изображением увеличенной в микроскоп блохи, вши, мухи, комара, клетки растения. По сути, этот труд представлял собой удивительное описание возможностей микроскопа.
Интересный факт: термин «клетка» Роберт Гук взял потому, что клетки растений ограниченные стенами напомнили ему монашеские кельи.
Так выглядел микроскоп Робета Гука, изображение из «Микрографии».
И последним выдающимся ученым, который внес свой вклад в развитие микроскопов, был голландец Антонии ван Левенгук. Вдохновленный трудом Роберта Гука, «Микрографией», Левенгук создал свой собственный микроскоп. Микроскоп Левенгука, хотя и обладал лишь одной линзой, но она была чрезвычайно сильной, таким образом, уровень детализации и увеличения у его микроскопа был лучшим на то время. Наблюдая в микроскоп живую природу, Левенгук сделал множество важнейших научных открытий в биологии: он первым увидел эритроциты, описал бактерии, дрожжи, зарисовал сперматозоиды и строение глаз насекомых, открыл инфузории и описал многие их формы
Работы Левенгука дали огромный толчок к развитию биологии, и помогли привлечь внимание биологов к микроскопу, сделали его неотъемлемой частью биологических исследований, аж по сей день. Такая в общих чертах история открытия микроскопа
