Содержание
Как работает микроскоп
В работе микроскопа присутствует тот же принцип, что и в телескопе-рефлекторе. В телескопе лучи света, когда проходят через стекло или стеклянную линзу, преломляются под определённым углом. Телескоп собирает параллельные лучи воедино в точку фокуса, откуда с помощью окуляра мы можем её видеть. Что касается микроскопа, то тут очень схожий принцип действия. Сперва расходящийся пучок света становится параллельным, после чего преломляется в окуляре, чтоб наблюдающий мог разглядеть картинку.
- Окуляр
- Тубус
- Держатель
- Винт грубой фокусировки
- Винт точной (микрометренной) фокусировки
- Револьверная головка
- Объектив
- Предметный столик
- Осветитель
- Ирисовая полевая диафрагма
- Зеркало
- Ирисовая апертурная диафрагма
- Конденсор
- Препарат
- Увеличенное действительное промежуточное изображение препарата, образуемое объективом
- Увеличенное мнимое окончательное изображение препарата, наблюдаемое в окуляре
- Объектив
- Окуляр
История создания микроскопа
Создание микроскопа имеет многовековую историю. Прибор прошел путь от простой трубки, в которую едва что-то можно было рассмотреть, до электронного устройства огромной мощности с большими увеличительными возможностями.
Один из первых микроскопов
Поскольку ранее наукой интересовались богатые люди, заказанные ими единичные экземпляры микроскопов украшались дорогими камнями и золотом, футляры для их хранения изготавливались из слоновой кости и ценного дерева.
В настоящее время существует множество микроскопов, они находят применение в разных сферах деятельности человека: медицине, промышленности, археологии, электронике и др.
Микроскоп Захария Янссена (XVI век)
Первый микроскоп создал нидерландский мастер по изготовлению очков Захарий Янссен. Это была обычная трубка с двумя линзами на концах. Настройку изображения выполняли, выдвигая трубку (тубус). Этот простой микроскоп стал основой для создания более сложных приборов.
Микроскоп Гука (середина XVII века)
Роберт Гук собрал очень удобную модель микроскопа: тубус можно было наклонять. Чтобы получить хорошее освещение, ученый придумал специальную масляную лампу и стеклянный шар, который наполнялся водой.
Микроскоп Галилея (начало XVII века)
Галилео Галилей доработал трубу Янссена, заменив одну из выпуклых линз на вогнутую. При выдвижении тубуса этот микроскоп служил еще и телескопом. Предположительно микроскоп Галилея изготовил мастер Джузеппе Кампаньи из дерева, картона и кожи и поставил на трехногую подставку из металла.
Микроскоп Левенгука (середина XVII века)
Изобретение Левенгука представляло собой две небольшие пластины, между которыми крепилась крошечная линза, а исследуемый объект помещался на иглу. Передвигать иглу можно было с помощью специального винта. Микроскоп мог увеличить изображение в 300 раз, что было немыслимо для той поры.
Микроскоп Иоганна ван Мушенбрука (конец XVII века)
Иоганн ван Мушенбрук создал необычный и простой в использовании микроскоп. Линза и держатель крепились с помощью подвижных соединений, названных «орехами Мушенбрука». Это придавало микроскопу большую гибкость.
Микроскоп Дреббеля (XVII век)
Микроскоп Дреббеля — это позолоченная труба, которая находилась в строго вертикальном положении. Работать за таким микроскопом было не очень удобно.
Микроскоп фирмы Шевалье (XIX век)
Наука шагнула далеко вперед. Фирма Шевалье стала производить микроскопы, объектив которых состоял уже не из одной простой, а из многих специально отшлифованных ахроматических линз. Это позволяло достигать большой мощности и передавать изображение без искажений и более четко.
Электронный микроскоп (XX век)
Появляются электронные микроскопы. Ученые заменили пучок света на поток микрочастиц — электронов. Для получения изображения в электронном микроскопе используются специальные магнитные линзы, они управляют движением электронов с помощью магнитного поля.
USB-микроскоп (конец XX века)
USB-микроскоп — это небольшой цифровой прибор, который присоединяется к компьютеру через USB-порт. Вместо окуляра — маленькая веб-камера, которая посылает изображение прямо на монитор компьютера.
Описание метода конфокальной микроскопии
Благодаря конфокальной флуоресцентной микроскопии появилась возможность получать трехмерное субмикронное расширение объектов, а также значительно расширилась возможность проведения неразрушающего анализа прозрачных образцов. Благодаря использованию в указанных микроскопах в качестве источников света лазеров, достигается повышение их разрешающей способности.
По сравнению с ксеновыми или ртутными лампами лазеры отличаются существенными преимуществами, так как обладают способностью монохроматичности, а также высокой параллельности испускаемого пучка света. Такие свойства лазерного излучения обеспечивают оптической системе более эффективную работу, а также снижают количество бликов и увеличивают точность фокусировки пучка света.
На исследуемом образце лазер освещает не все поле зрения, а фокусируется в определенной точке. Конфокальная диафрагма позволяет избавиться от внефокусной флуоресценции, при этом изменяя диаметр диафрагмы, можно точно определять толщину оптического слоя возле фокуса лазерного луча. Благодаря описанному свойству конфокальная микроскопия позволяет получать улучшенное разрешение вдоль оси Z.
Специальные программы, которыми оснащены конфокальные микроскопы, позволяют из серии оптических срезов создавать объемные изображения объектов, а также рассматривать их под разными углами зрения.
Применение мультиспектрального лазерного сканирующего конфокального микроскопа дает возможность изучать колоколизацию в клетке различных веществ. Мультиспектральный режим позволяет проводить на конфокальном микроскопе исследования по методу FISH.
Оборудование — конфокальные микроскопы
Современные сверхточные конфокальные микроскопы, такие как Leica TCS SP8 позволяют получить максимально четкие и достоверные данные при проведении различных исследований. Широкий интерес к таким приборам возник в восьмидесятых годах прошлого столетия, из-за быстрого развития компьютерной техники и лазерных технологий.
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия представляет собой разновидность оптической микроскопии. Ее особенностью является то, что лазерный луч фокусируется на определенную область по осям Х и У и формирует, таким образом, изображение. Отраженный свет демонстрируется на экране в виде растра. Размеры изображения напрямую зависят от разрешающей способности современной электроники, а также от размеров сканируемого растра.
Измерительные приборы, которые созданы с помощью современного метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, в наше время получили широчайшее распространение в разных сферах. По сравнению с обычной световой микроскопией конфокальная микроскопия обладает следующими преимуществами:
- улучшенная разрешающая способность;
- высокая контрастность изображения;
- возможность проводить мультиспектральные исследования с высокой степенью разделения сигналов;
- возможность получения «оптических срезов» с трехмерной реконструкцией;
- возможности использования способов цифровой обработки полученных изображений;
Из недостатков описанной аппаратуры можно выделить:
- сложность настройки прибора;
- отсутствие оптического изображения;
- высокая стоимость приборов, также дороговизна их обслуживания.
В конфокальном микроскопе для управления всей системой используется специальный компьютер. Он позволяет сохранять изображения и детально изучать полученные данные. Для качественной обработки полученных изображений зачастую требуются достаточно большие вычислительные мощности, поэтому компьютер должен обладать довольно большой оперативной памятью. Для дальнейшего хранения информации требуется также и большая дисковая память. Для передачи изображений такой компьютер должен иметь USB-порт или CD/DVDRW. Также компьютер имеет возможность подключения к глобальной интернет или локальной сети.
Программное обеспечение, установленное в таких компьютерах, может быть базовым. Оно поставляется вместе с техникой и позволяет управлять всей системой и контролировать ее основные функции. Также для указанных компьютеров специально разрабатываются пакеты прикладных задач, которые заказываются дополнительно. Многие модели конфокальных микроскопов имеют специальный пульт управления, позволяющий настраивать их работу дистанционно.
Устанавливают описанные приборы в обычных лабораторных посещениях. Важнейшей процедурой в процессе эксплуатации конфокальных микроскопов является контроль за вибрациями. Для таких целей применяют специальное устройство, измеряющее уровень вибрации. Процедура контроля похожа на процедуру измерения аксиальной разрешающей способности ЛСКМ при помощи зеркала.
Конфокальная микроскопия стремительно развивается. Известные компании-производители представляют на рынке новейшие образцы конфокальных микроскопов, которые позволяют эффективно разделять лазерный луч возбуждения, а также люминесценцию. С помощью компьютера в таких приборах управляется светоделитель. Его спектральные свойства при необходимости могут достаточно быстро перестраиваться на несколько лазерных линий.
Конфокальные микроскопы в микробиологии
Конфокальный микроскоп также незаменим в биологии для детального исследования клетки. Сегодня на эту тему публикуется огромное количество различных научных статей. Чаще всего при помощи конфокальных микроскопов изучают структуру клеток, а также их органоидов. Также исследуется колокализация в клетке для того, чтобы понять есть ли причинно-следственная связь между веществами клетки.
В процессе изучения белков конфокальными микросокпами они предварительно маркируются антителами с разными флуорохромами. С помощью обычного классического микроскопа довольно трудно разобрать расположены ли они рядом либо же один под другим, а вот конфокальный микроскоп позволяет это сделать без особых проблем. В памяти компьютера записываются данные о серии оптических срезов и, таким образом, проводится объемная реконструкция объекта, атакже получается его трехмерное изображение.
Также с помощью конфокальных микроскопов исследуют динамическое процессы, протекающие в живых клетках, например, передвижение ионов кальция или других веществ сквозь клеточные мембраны. Используют конфокальные микроскопы и для изучения подвижности биоорганических молекул с помощью ионизации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения, а также последующего его рассоединения с молекулами. Такие молекулы маркируются двумя флуорохромами, обладающими спектром испускания донора, который перекрывается спектром поглощения акцептора. Таким образом, энергия передается от донора к акцептору на небольших расстояниях и в результате резонанса между энергетическими уровнями. После этого акцептор в видимой области спектра излучает энергию, которая впоследствии регистрируется с помощью конфокального микроскопа.
Развитие конфокальной микроскопии продолжается. Компании-производители указанного оборудования ежегодно представляют на рынке все более современные, функциональные и усовершенствованные микроскопы, позволяющие ученым совершать новые полезные открытия в самых разных сферах. Совершенствуется и программное обеспечение, предназначенное для компьютеров, которыми оснащены конфокальные микроскопы. Оно позволяет воплощать в жизнь самые сложные задачи, которые дают возможность проводить исследования на молекулярном и клеточном уровне. Сегодня с уверенностью можно сказать, что за конфокальными микроскопами будущее, так как по своим функциональным характеристикам и техническим возможностям они существенно превзошли обычные микроскопы. Среди достаточно широкого ассортимента конфокальной оптической аппаратуры каждый пользователь сможет подобрать для себя именно торт микроскоп, который позволит ему активно развивать свои исследования.
Виды микроскопов
На сегодняшний момент существует множество разновидностей данного прибора. Микроскопы бывают: оптические и электронные, рентгеновские и сканирующие зондовые. Есть также дифференциальный интерференционно-контрастный микроскоп.
Оптические приборы в свою очередь делятся на ближнепольные, конфокальные и двухфотонные лазерные микроскопы. Электронные подразделяются на просвечивающие и растровые устройства. Сканирующие представляют собой совокупность атомно-силовых и туннельных микроскопов, а рентгеновские приборы бывают лазерными, отражательными и проекционными.
Естественной оптической системой является глаз человека. При этом она характеризуется точным разрешением. Нормальное разрешение для обычного глаза составляет примерно 0,2 мм. Это характерно при удалении объекта на расстояние оптимального видения, которое составляет 250 мм. Стоит заметить, что размеры животных и растительных клеток, различных микроорганизмов, деталей структуры металлов и разного рода сплавов, а также мелких кристаллов намного меньше нормального разрешения для человеческого глаза.
Ученые примерно до середины прошлого века использовали в работе только видимое оптическое излучение, диапазоном от четырехсот до семисот нанометров. Иногда применялись приборы с ближним ультрафиолетом. Получается, что оптические микроскопы способны различать вещества с расстоянием между элементами до 0,20 мкм, а это значит, что он может добиться максимального увеличения 2000 крат.
В электронных устройствах для увеличения используется пучок электронов, обладающих волновыми свойствами. При этом электроны достаточно легко можно сфокусировать при помощи электромагнитных линз, потому что они представляют собой заряженные частицы. К тому же электронное изображение не составит труда перевести в видимое.
У электронных устройств разрешающая способность в несколько тысяч раз превышает разрешение светового оптического микроскопа. А в современных приборах она может быть даже менее десяти нанометров.
Сканирующие зондирующие микроскопы – это класс приборов, работа которых основана на сканировании зондом различных поверхностей. Это достаточно новые устройства, изображение на которых получается при помощи фиксирования соприкосновений между поверхностью и зондом. На данный момент в таких устройствах удалось добиться фиксации взаимодействия зонда с некоторыми молекулами и атомами, что выводит сканирующий зондирующий микроскоп на уровень электронных приборов. А в некоторых показателях такие устройства даже превосходят их.
Рентгеновские микроскопы представляют собой прибор, позволяющий исследовать очень малые объекты, величины которых можно сопоставить с длиной рентгеновской волны. Работа такого прибора основана на электромагнитном излучении, имеющим длину волны до одного нанометра. Разрешающая способность рентгеновских устройств намного выше оптических, но ниже электронных микроскопов.
Особенности исследования отдельных молекул и микроорганизмов
В теории можно сделать изображение какой-либо молекулы, используя оптические устройства, красящие вещества, ультрафиолет и светофильтр. Объект исследования должен флюоресцировать на темном фоне, а остальные частицы нет. Их цветовое значение близко к нулю.
Детектор микроскопа распознает не только излучение нужной молекулы, но и реагирует на иные фотоны. Они попадают на люминесцентное устройство от других источников света.
Сейчас для детального анализа образца применяют оптико-механические приборы и электронно-вычислительную технику. С помощью современного программного обеспечения ее подключают к монитору. На него выводится трехмерное изображение. После получения информации о координатах новых частиц компьютер микроскопа запоминает их расположение. Они исчезают с экрана.
Для осуществления наблюдения нужен стереомикроскоп.
Получить изображение объекта легко с помощью оптики, дополнительной техники и ПО. Качество снимка будет ниже, чем при применении люминесцентного устройства. Иногда для наблюдений такой способ допускается, т.к. не всегда требуется сверхвысокое разрешение.
Для осуществления наблюдения понадобятся:
- простой стереомикроскоп;
- источник возбуждения излучения;
- светофильтры для блокировки света возбуждения и удерживания свечения объектов, создающих ненужный фон;
- система для проецирования полученной картинки на фотокамеру;
- компьютер с ПО для запечатления и обработки изображений.
Виды микроскопов
За всю историю развития микроскопной техники было изобретено множество приборов. Все они отличались устройством и принципом действия. Основные виды микроскопов:
- оптические;
- электронные;
- сканирующие зондовые;
- рентгеновские.
Оптические и электронные
Самым простым и недорогим устройством считается оптический прибор. По своим техническим параметрам он позволяет увеличивать изображение объекта в 2 тыс. раз. Благодаря такому высокому показателю, с помощью оптического микроскопа можно исследовать:
- структуру клеток;
- поверхность ткани;
- дефекты на искусственных объектах и т. д.
Более современным прибором считается электронный микроскоп, который может увеличивать изображение предмета в 20 тыс. раз. От оптического устройства он отличается тем, что вместо луча света используется пучок электронов. Специальные магнитные линзы преобразовывают в изображение перемещение отрицательно заряженных частиц, а направленность пучка регулируется изменением магнитного поля.
Использование прибора в комплексе с компьютером позволяет значительно увеличить изображение и одновременно сделать снимок объекта. Недостатком таких устройств считается высокая стоимость и их эксплуатация только в лабораторных условиях, так как молекулы воздуха воздействуют на электроны, нарушая четкость изображения. Кроме того, чтобы на функционирование микроскопа не влияли внешние магнитные поля, лаборатории размещают в подземных бункерах с толстыми стенами.
Зондовые и рентгеновские
Сканирующие устройства позволяют получить нужное изображение с помощью специального зонда, который выполняет роль объектива и проводит исследование объекта. В итоге получается трехмерное изображение с точными характеристиками исследуемого предмета. Эта новая техника обладает довольно высоким разрешением, а зонд представляет собой сложный механизм, оснащенный чувствительными сенсорами, которые реагируют на перемещение электронов.
Зачастую такие конструкции используются для сканирования объектов со сложным рельефом. Сканерами исследуются внутренние пространства труб и мелких тоннелей. В результате исследования полученные первоначальные показатели обрабатываются математическим методом с помощью специальной компьютерной программы.
Для исследования предметов, размеры которых соизмеримы с длиной электромагнитных волн от 10 до 0,001 нм, применяются рентгеновские микроскопы. По своим характеристикам и эффективности работы эти приборы находятся между оптическими и электронными устройствами. Рентгеновские волны могут проникать сквозь поверхность объекта, поэтому существует возможность, кроме структуры предмета, узнать его химический состав.
Электронные микроскопы: системы
Источником электронов является электронная пушка, состоящая из V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900°С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом.
Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличение объекта.
После объективной линзы электроны попадают в промежуточную линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца.
Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцентный экран.
Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование.
Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.
Электронномикроскопическому исследованию могут быть подвергнуты как ультратонкие срезы различных тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные культуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами.
Принцип работы
Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) — это тип электронного микроскопа, который изображает образец, сканируя его сфокусированным пучком заряженных электронов в растровом сканирующем узоре (прямоугольном узоре захвата и реконструкции изображения). Различные сигналы, которые могут быть обнаружены, когда электроны взаимодействуют с атомами в образце, где сигналы могут быть интерпретированы в информацию о свойствах поверхности образца. Затем положение луча комбинируется с обнаруженным сигналом для получения изображения. СЭМ может достигать разрешения лучше, чем 1 нанометр. Образцы можно наблюдать в высоком вакууме, в низком вакууме, во влажных условиях, в окружающей среде, а также в широком диапазоне криогенных или повышенных температур.
Наиболее распространенным режимом СЭМ является обнаружение вторичных электронов, испускаемых атомами, возбужденными электронным пучком. Количество вторичных электронов зависит от угла, под которым пучок встречается с поверхностью образца. При сканировании образца и сборе вторичных электронов с помощью специального детектора создается изображение, отображающее топографию поверхности.
Как следует из названия, СЭМ использует электронную пушку, которая испускает сфокусированный пучок электронов высокой энергии, заменяющий источник света, используемый в оптическом микроскопе.
Достоинства
- Сила увеличения составляет около 300 000 х по сравнению с несколькими сотнями раз, которые производит оптический.
- Обеспечивает большую глубину резкости по сравнению с оптическими, что позволяет сложным 3D-объектам оставаться четкими и в фокусе.
- Можно делать высококачественные цифровые фотографии всего, что видно в это устройство.
Недостатки
- Недостатки обычного СЭМ заключаются в том, что образец должен быть твердым и небольшим, чтобы он мог поместиться внутри камеры.
- Очень легкие элементы, такие как H, He, Li и элементы, которые находятся ниже атомного номера 14, не могут быть обнаружены с помощью этого типа.
- Самые дешевые стоят около десятков тысяч долларов и являются достаточно громоздкими и сложными инструментами, требующими высокой технической экспертизы и подготовки при обращении.
Таким образом, эти факты ограничивают использование при исследованиях и промышленном применении.
Правила работы с микроскопом
- Работать с микроскопом необходимо сидя;
- Перед работой микроскоп необходимо проверить и протереть от пыли мягкой салфеткой;
- Установить микроскоп перед собой немного слева;
- Начинать работу стоит с малого увеличения;
- Установить освещение в поле зрения микроскопа, используя электроосветитель или зеркало. Глядя одним глазом в окуляр и пользуясь зеркалом с вогнутой стороной, направить свет от окна в объектив, а затем максимально и равномерно осветить поле зрения. Если микроскоп снабжен осветителем, то подсоединить микроскоп к источнику питания, включить лампу и установить необходимую яркость горения;
- Положить микропрепарат на предметный столик так, чтобы изучаемый объект находился под объективом. Глядя сбоку, опускать объектив при помощи макровинта до тех пор, пока расстояние между нижней линзой объектива и микропрепаратом не станет 4-5 мм;
- Передвигая препарат рукой, найти нужное место, расположить его в центре поля зрения микроскопа;
- Для изучения объекта при большом увеличении, сначала нужно поставить выбранный участок в центр поля зрения микроскопа при малом увеличении. Затем поменять объектив на 40 х, поворачивая револьвер, так чтобы он занял рабочее положение. При помощи микрометренного винта добиться хорошего изображения объекта. На коробке микрометренного механизма имеются две черточки, а на микрометренном винте – точка, которая должна все время находиться между черточками. Если она выходит за их пределы, ее необходимо возвратить в нормальное положение. При несоблюдении этого правила, микрометренный винт может перестать действовать;
- По завершении работы с большим увеличением, установить малое увеличение, поднять объектив, снять с рабочего столика препарат, протереть чистой салфеткой все части микроскопа, накрыть его полиэтиленовым пакетом и поставить в шкаф.
История создания
Хотя первые увеличительные линзы, на основе которых собственно и работает световой микроскоп, археологи находили еще при раскопках древнего Вавилона, тем не менее, первые микроскопы появились в Средневековье. Что интересно, среди историков нет согласия по поводу того, кто первым изобрел микроскоп. Среди кандидатов на эту почтенную роль такие известные ученые и изобретатели как Галилео Галилей, Христиан Гюйгенс, Роберт Гук и Антонии ван Левенгук.
Стоит также упомянуть итальянского врача Г. Фракосторо, который еще в далеком 1538 году первым предложил совместить несколько линз, чтобы получить больший увеличительный эффект. Это еще не было созданием микроскопа, но стало предтечей его возникновения.
А в 1590 году некто Ханс Ясен, голландский мастер по созданию очков заявил, что его сын – Захарий Ясен – изобрел первый микроскоп, для людей Средневековья такое изобретение было сродни маленькому чуду. Однако, ряд историков сомневается в том, является ли Захарий Ясен истинным изобретателем микроскопа. Дело в том, что в его биографии немало темных пятен, в том числе пятен и на его репутации, так современники обвиняли Захарию в фальшивомонетчестве и краже чужой интеллектуальной собственности. Как бы там ни было, но точно узнать был ли Захарий Ясен изобретателем микроскопа или нет, мы, к сожалению, не можем.
А вот репутация Галилео Галилея в этом плане безупречна. Этого человека мы знаем, прежде всего, как, великого астронома, ученого, гонимого католической церковью за свои убеждения о том, что Земля вращается вокруг Солнца, а не наоборот. Среди важных изобретений Галилея – первый телескоп, с помощью которого ученый проник своим взором в космические сферы. Но сфера его интересов не ограничивалась лишь звездами и планетами, ведь микроскоп, это по сути тот же телескоп, но только наоборот. И если с помощью увеличительных линз можно наблюдать за далекими планетами, то почему бы не обратить их мощь в другое направление – изучить то, что находится у нас «под носом». «Почему бы и нет», – наверное, подумал Галилей, и вот, в 1609 году он уже представляет широкой публике в Академии деи Личеи свой первый составной микроскоп, который состоял из выпуклой и вогнутой увеличительных линз.
Старинные микроскопы.
Позднее, спустя 10 лет, голландский изобретатель Корнелиус Дреббель усовершенствовал микроскоп Галилея, добавив в него еще одну выпуклую линзу. Но настоящую революцию в развитии микроскопов совершил Христиан Гюйгенс, голландский физик, механик и астроном. Так он первым создал микроскоп с двухлинзовой системой окуляров, которые регулировались ахроматически. Стоит заметить, что окуляры Гюйгенса применяются и по сей день.
А вот знаменитый английский изобретатель и ученый Роберт Гук навеки вошел в историю науки, не только как создатель собственного оригинального микроскопа, но и как человек, сделавший при его помощи великое научное открытие. Именно он первым увидел через микроскоп органическую клетку, и предположил, что все живые организмы состоят из клеток, этих мельчайших единиц живой материи. Результаты своих наблюдений Роберт Гук опубликовал в своем фундаментальном труде – Микрографии.
Опубликованная в 1665 году Лондонским королевским обществом, эта книга тут же стала научным бестселером тех времен и произвела подлинный фурор в научном сообществе. Еще бы, ведь в ней имелись гравюры с изображением увеличенной в микроскоп блохи, вши, мухи, комара, клетки растения. По сути, этот труд представлял собой удивительное описание возможностей микроскопа.
Интересный факт: термин «клетка» Роберт Гук взял потому, что клетки растений ограниченные стенами напомнили ему монашеские кельи.
Так выглядел микроскоп Робета Гука, изображение из «Микрографии».
И последним выдающимся ученым, который внес свой вклад в развитие микроскопов, был голландец Антонии ван Левенгук. Вдохновленный трудом Роберта Гука, «Микрографией», Левенгук создал свой собственный микроскоп. Микроскоп Левенгука, хотя и обладал лишь одной линзой, но она была чрезвычайно сильной, таким образом, уровень детализации и увеличения у его микроскопа был лучшим на то время. Наблюдая в микроскоп живую природу, Левенгук сделал множество важнейших научных открытий в биологии: он первым увидел эритроциты, описал бактерии, дрожжи, зарисовал сперматозоиды и строение глаз насекомых, открыл инфузории и описал многие их формы
Работы Левенгука дали огромный толчок к развитию биологии, и помогли привлечь внимание биологов к микроскопу, сделали его неотъемлемой частью биологических исследований, аж по сей день. Такая в общих чертах история открытия микроскопа
Краткая историческая справка
Флуоресценцию открыл Джордж Стокс в 1852 г. Английский физик наблюдал ее у хининовых веществ. Позже ученые выяснили, что облучение ультрафиолетом приводит к свечению многих соединений. Флуоресценция характерна для витаминов, кристаллов, горных пород, масел и хлорофилла. Однако полученные сведения применили позднее.
В 1930-х гг. ученые-биологи стали окрашивать бактерии и клетки флюорохромами, способствующими свечению. Был придуман микроскоп для подобных исследований.
Применение флуоресценции позволило изучать микрообъекты с разрешением от 1 до 10 нм. Наноскопия может раскладывать частицы на отдельные молекулы.
Кратко о методе флуоресцентной микроскопии
Метод основан на способности фоточувствительных молекул к структурной интеграции с микрообъектами. Они прикрепляются к образцам с помощью функциональных химических групп и при световом облучении возвращают часть поглощенных фотонов.
Исследователи принимают и анализируют интенсивность волновых сигналов, делая выводы о строении изучаемых объектов и протекающих в них процессах.
Принцип флуоресценции соединений.
Какие процессы участвуют
При флуоресценции происходят поглощение квантов и их последующее частичное высвобождение. Электроны облучаемого флуорофора приобретают дополнительную энергию и на мгновение перемещаются на более высокий энергетический уровень.
При возвращении в первичное состояние происходит высвобождение фотонов во внешнюю среду. В этом процессе часть энергии тратится на восстановление термодинамического равновесия, поэтому величина испускаемой волны больше длины волны возбуждения. Разницу между энергиями возбуждающего и испускаемого излучений называют стоксовым сдвигом.
Формирование изображения
Микроскопы оснащены электронными модулями, позволяющими визуализировать исследуемые объекты при низких уровнях световых сигналов. Эти узлы содержат устройства с зарядовой связью, способные преобразовывать волновую энергию в фототок.
Далее электрические заряды сканируются регистрами сдвига и преобразуются в аналоговые, а затем в цифровые сигналы. На основе полученных данных формируется изображение высокого разрешения в 12- или 16-битном формате.
Ключом к качественной визуализации является правильный подбор оптических фильтров, гарантирующих надежное разделение испускаемого тусклого от возбуждающего яркого света.
Оптическая схема микроскопа.
Методы исследования
В люминесцентной микроскопии применяются различные методы исследований. Микробиологи используют флюорохромирование и реакцию иммунной флуоресценции. Вторую часто называют также методом флуоресцирующих тел.
Существует другой вид изучения молекул — конфокальная микроскопия. Она дает возможность исследовать частицы на той или иной глубине.
Флюорохромирование
Метод является распространенным в исследовании органов и тканей человека. Вторичную люминесценцию получают, обрабатывая образцы флюорохромами. Каждый предназначен для каких-либо целей.
Акридиновый оранжевый применяется для диагностики раковых заболеваний и инфаркта на ранних сроках. Ишемические участки имеют зелено-желтое свечение. Флюорохром применяют, чтобы выявлять кислые мукополисахариды. Если он взаимодействует с ДНК, появляется зеленая флуоресценция. Для реакции красителя на РНК характерна красная.
Флюорохромирование — это обработка флуорохромом с целью увеличения контрастности свечения.
Кофеин 5 и родамин применяются для определения гликогена в печени. Фосфин 3Р — для выявления липидов. Аналогичными свойствами обладает смесь растворов бензпирена и кофеина. Второй должен быть насыщенным. При наличии липидов появляется бело-голубая люминесценция.
Тиофлавин окрашивает особые белковые соединения при амилоидозе. Для него характерно зеленое свечение. При такой болезни внутренних органов в них образуются амилоиды.
Морин используют для определения содержания кальция в тканях. После обработки спиртовым раствором образцы имеют зеленую люминесценцию.
Черный солохром применяют для выявления алюминия. Он сопровождается желто-оранжевым свечением.
Реакция иммунной флюоресценции
Благодаря методу флуоресцирующих тел выявляют антитела, гормоны, продукты метаболизма и др. Реакция иммунной флюоресценции определяет рак и инфекции на ранних стадиях. Возможности таких исследований расширило развитие иммунохимии. Сейчас небелковые соединения в тканях выявляют искусственными гаптенами.
История возникновения
Микроскоп представляет собой прибор, с помощью которого можно значительно увеличить изображение, детально изучить строение и структур рассматриваемого объекта, а также замерить его детали, плохо различимые или вообще невидимые невооруженным глазом.
Методы и технологии, позволяющие использовать данный прибор в практических целях носят название микроскопия.
Самыми первыми изобретенными устройствами были оптические микроскопы. К тому же невозможно с уверенностью сказать о том, кому принадлежат лавры такого изобретения. В 1538 году венецианский врач Джироламо Фракасторо предложил использовать комбинацию из двух линз для достижения наибольшего увеличения. А самые ранние упоминания именно о микроскопе датируются 1590 годом и уходит корнями в голландский город Мидделбург, где работали двое мастеров Иоанн Липперсгей и Захарий Янсен, которые изготавливали очки.
Примерно в 1624 году свой первый составной прибор под названием «оккиолино», что в переводе с итальянского означает «маленький глаз», представил итальянский физик и астроном Галилео Галилей. И только спустя год его товарищ Джованни Фабер предложил называть полученное изобретение микроскопом.
